逆转座子是一类可以通过“复制-粘贴”的方式在基因组上发生跳跃的DNA元件。R2是低等真核生物中广泛存在的一种逆转座子。它们专一性地“寄生”在宿主基因组的28S核糖体DNA中，借助宿主基因的启动子，合成自身的mRNA和蛋白质并组装形成R2复合物（“复制”过程）；R2复合物可再次识别宿主28S核糖体DNA上的专一性位点，通过核酸酶（endonuclease, EN）结构域切开DNA双链，再通过逆转录酶（reverse transcriptase, RT）结构域逆转录合成cDNA，将R2基因序列重新整合到宿主基因组上（“粘贴”过程），完成“增殖”。
有趣的是，逆转座子等可移动的DNA元件在基因组上跳跃的过程中，极大地丰富了基因组的组成，被认为在基因组进化的过程中扮演着重要的作用。因此，理解逆转座子在基因组上跳跃的分子机制将有助于思考“我们的基因组从哪里来、如何来”的问题。此外，利用逆转座子在基因组上跳跃的性质，开发新的核酸操纵工具，将具有巨大的应用前景（Science， 2023）。
图1. 逆转座子在基因组上跳跃的示意图
2023年6月9日，清华大学生命学院刘俊杰 (Jun-Jie Gogo Liu) 课题组在Cell杂志在线发表了题为Structural RNA components supervise the sequential DNA cleavage in R2 retrotransposon的研究论文。研究人员报道了R2逆转座子的mRNA中存在两段结构性的RNA，共同调控顺序性的DNA双链切割，从而保证逆转座的准确进行。此外，课题组还将第二类内含子（Group II intron）、LINE-1逆转座子与R2逆转座子进行了比较，总结了生物大分子进化过程中，以RNA为主导逐渐过渡到以蛋白质为主导的进化趋势，提出了新颖的见解。
研究人员发现, 位于R2 mRNA 3’端非翻译区的RNA（3’-RNA）在R2蛋白质切割DNA双链的过程中，表现出促进第一条链切割、抑制第二条链切割的作用；位于5’端翻译区的RNA（5’-RNA）则表现出降低第一条链切割、激活第二条链切割的作用；而当5’-RNA与3’-RNA同时存在时，总是表现出3’-RNA的调控作用，并且完全抑制第二条链的切割。为了进一步理解其中的分子机制，研究人员解析了R2逆转座子在3’-RNA结合状态和5’-RNA结合状态的高分辨结构。在3’-RNA结合状态中，DNA底物被蛋白质特异性识别，3’-RNA核心区域结合在RNA结合（RNA binding, RB）结构域上。在5’-RNA结合状态中，5’-RNA呈现出复杂的“三爪（three-claw）”结构，紧密的包裹住蛋白质核心。值得注意的是，5’-RNA的其中一个爪（Claw3）同样结合在RB结构域上，且生化分析表明，Claw3对激活第二条链切割是必要的。
图2. 3’-RNA结合状态（左）和5’-RNA结合状态（右）的复合物结构
此外，研究人员用一段连接序列将5’-RNA与3’-RNA连接成一条RNA，设计了R2全长mRNA的模拟物（L-RNA），并获得了R2逆转座子在L-RNA结合状态的结构。在这个结构中，5’-RNA同样以“三爪”的形式与蛋白质核心紧密结合，但由于3’-RNA的挤占，起激活第二条链切割作用的Claw3未能与RB结构域结合。研究人员发现，L-RNA中3’-RNA与蛋白质RB结构域的结合将抑制第二条链的切割，但当提供dNTP作为原料，使逆转录可以发生后，3’-RNA在作为逆转录模板的过程中逐渐从RB结构域上解离下来，5’-RNA得以与RB结构域结合，从而激活第二条链的切割。
图3. L-RNA结合状态的复合物结构与RNA监督DNA双链顺序性切割的示意图
综合以上分析，研究人员总结得出了R2逆转座子在基因组上跳跃的分子机制：R2蛋白质特异性识别28S核糖体DNA序列后，蛋白质RB结构域首先结合R2 mRNA上的3’-RNA，促进第一条DNA链的切割，同时抑制第二条链的切割，仅暴露出第一条链的3’-OH作为引物，从mRNA的3’端起始逆转录过程（Target primed reverse transcription, TPRT），随着逆转录的进行，位于mRNA 3’端的3’-RNA逐渐从蛋白质RB结构域解离，对第二条链切割的抑制作用得以释放，R2 mRNA上的5’-RNA与RB结构域的结合进一步激活了第二条链的切割。由此，位于mRNA两端的结构性RNA共同监督了DNA双链的顺序性切割。这种严密的顺序性切割保障了依赖宿主基因表达元件的R2逆转座子进行“有效的增殖”，在28S核糖体DNA中不断产生有活性的拷贝。
图4. R2逆转座子在基因组上发生跳跃的分子机制与意义
有趣的是，研究人员将低等真核生物的R2逆转座子与其祖先（原核生物第二类内含子，Group II intron）和哺乳动物中的LINE-1逆转座子进行了比较，发现在Group II intron向R2逆转座子及进一步向LINE-1逆转座子进化的过程中，RNA的结构性组分逐渐减少并被编码区域所取代，并且催化功能逐渐从以RNA为主导过渡到以蛋白质为主导，为理解生物大分子进化提供了新的视角。此外，LINE-1在哺乳动物基因组中广泛存在且具有逆转座活性，为基因组提供进化驱动力的同时，也为基因组稳定性和基因表达带来了重大的影响。对R2逆转座子在基因组上跳跃的分子机制的研究，将启发我们思考LINE-1逆转座子这类“自私的基因”与基因组之间精彩的博弈过程。
图5. 逆转座子中RNA与蛋白质共进化趋势的示意图
清华大学生命学院刘俊杰助理教授和副研究员王家为该文共同通讯作者；清华大学生命学院博士后邓谱涓和博士生谭顺青为该文共同第一作者；此外，该项研究工作得到了中国科学院动物研究所王皓毅研究员、清华大学生命学院张强锋副教授、吝易助理教授等合作者的大力支持。美国Broad研究所张锋教授和Max E. Wilkinson博士在原子模型搭建中提供了宝贵的建议。
清华大学刘俊杰课题组长期关注DNA和RNA核酸酶研究及相关核酸操纵工具的开发和应用。综合运用生物信息学、结构生物学、生物化学和细胞生物学手段，刘俊杰课题组及合作者已鉴定并开发了多种新型基因编辑工具（Nature, 2019；Mol. Cell, 2022；Cell Res., 2023），欢迎对基因编辑或RNA生物学感兴趣，尤其是有细胞生物学或生物信息学等学科背景的同学加入刘俊杰课题组（实验室网页http://gogolab.life.tsinghua.edu.cn）。
专家点评：刘念（清华大学生命学院助理教授）
逆转座子是基因组中一类占比非常大、并且功能没有被完全理解的DNA元件，常被成为是基因组中的暗物质。它们首先转录成RNA，然后逆转录成cDNA，并插入到基因组中。通过这种自我复制的形式，逆转座子已经占据了接近一半的人基因组。并且，逆转座子至今仍在人基因组中活跃跳跃和复制。近年来的一些研究表明，活跃的逆转座子与一些重要发育过程和上百种疾病相关，改变着人类基因组，可能继续对人基因组进化和基因功能多样化产生重要的影响。
逆转座子自我复制过程中的逆转录和基因组插入整合步骤的机制至今仍不清晰。清华大学刘俊杰实验室研究了昆虫中R2逆转座子在逆转录和基因整合过程中的机制，解析了R2 的RNA-protein interactions在此过程中的变化，展示了RNA分子协调逆转录元件整合基因组中的神奇功能。这些结果展示了RNA在低等真核生物逆转录过程中扮演着重要的操纵作用，对我们了解哺乳动物细胞中逆转座子在基因组中扩增的机制提供了重要的结构基础，具有影响深远的重大意义。
专家点评：刘君（北京大学生命科学学院研究员）
逆转座子是一类具有自我复制能力的遗传元件，通过逆转录将自身的RNA逆转录成cDNA，并插入到基因组的新位置。这种自我复制的能力使得逆转座子在基因组中活跃跳跃，持续增加拷贝数目。经过漫长的进化过程，逆转座子在基因组中占比很大，比如人类基因组约占一半，是基因组的重要组成部分。尽管数量庞大且分布广泛，逆转座子的存在长期未引起足够关注，功能也未完全理解。最近的研究发现活跃的逆转座子通过调控基因的表达参与许多重要的生物学过程，并与多种疾病相关。然而，目前逆转座子在基因组上发挥功能的第一步——如何在基因组上发生跳跃的具体分子机制尚不明晰，影响了人们对其功能的进一步了解。
清华大学刘俊杰实验室在这个问题上给我们提供了一个很好的解答。他们通过冷冻电镜解析逆转座子R2在逆转录和基因整合过程中涉及到的RNA-蛋白之间的相互作用，对其调控机制进行了深入研究。R2是低等真核生物中广泛存在的逆转座子，能够剪切和插入自身或其他DNA序列到基因组的不同位置，由于活跃性较高，还被用作基因编辑工具。刘俊杰课题组的研究结果揭示了R2 RNA的不同区域通过耦合逆转录与R2蛋白次序性的结合，实现对DNA双链的顺序切割，从而确保R2在基因组上有效扩增。这些结果展示了RNA在逆转座子转座过程中所起到的关键作用，对于理解基因组的构成及优化基因编辑工具提供了重要的结构基础。此外，研究还提到了LINE-1逆转座子与R2结构的差异，引发了我们关于高等生物中逆转座子在基因组中的扩增机制和RNA作用差异的思考，对进一步理解真核生物基因组及基因表达调控的复杂性具有重要的参考价值。
原文链接：https://doi.org/10.1016/j.cell.2023.05.032
