相比于传统的组织活检，液体活检具有无创性、敏感性、动态性等特质，其出现标志着人类在攻克肿瘤癌症的道路上又前进了一大步。因此，在介绍具体的肿瘤基因及分子检测技术之前，先在此简述液体活检的基本情况。
1、液体活检
■ 液体活检是什么？
液体活检是指，在体液样本中提取分子标志物进行检测分析，为患者的疾病诊疗提供决策信息。实际上，从肿瘤取样角度、相对组织活检而言，液体活检是一类技术术语，且正在不断演化及发展，并无确切定义。
■ 发展历程
■ 范畴
液体活检的采样类型包括：血液（外周血）、唾液、尿液、脑脊液、胸腔积液等；
液体活检分析的分子标志物包括：ctDNA、CTC、外泌体（外囊泡的一种）、肿瘤培养的血小板等。根据美国病理协会官网，液体活检目前的重点是 ctDNA，其他包括 RNA、CTC、细胞外囊泡（EV）和肿瘤培养的血小板（TEP）。
■ 应用
液体活检主要基于肿瘤释放的细胞及核酸（DNA 和 RNA）来评估治疗反应（预后监测、残留疾病检测）、预测肿瘤复发风险、追踪与耐药性相关的突变、可靶向的驱动突变研究和临床试验注册等，可以应用于应用于肿瘤分子分型、肿瘤演变及预后监测等场景。
■ 优势
在临床应用中，组织活检通常是肿瘤诊断和治疗的金标准，但存在两方面弊端：一是侵入性意味着样本有时无法取得，需要考虑肿瘤的位置和患者的状态；二是组织样本的含量低等无法满足 NGS 等检测的要求。
相对组织活检，液体活检的整体优势主要在于获得侵入性要小得多，允许频繁、连续的采样，从而持续追踪肿瘤发展及预后反应；另外可以在无法进行组织活检下进行液体活检。
■ 前景
据美国病理协会，短期内液体活检可能更有助于确认临床或放射学上已明显病变患者的恶性肿瘤；此外，其是组织活检不可执行情况下的可选方案。
基于已获批产品，液体活检也大大加速了新药研发的靶点发现、临床试验入组以及伴随诊断的发展，在预后检测、复发评估等方面有着巨大的前景，核心挑战是提高灵敏度。该领域的下一个挑战和机会是将液体活检纳入常规癌症筛查计划，以促进癌症早期诊断。
液体活检包括多种技术，以下将介绍其中最具代表性的几种。
2、荧光定量PCR（qPCR）及数字PCR（dPCR）
■ 定义及意义
PCR（Polymerase Chain Reactio，聚合酶链式反应）是在体外模拟 DNA 复制的过程，快速扩增特定基因或 DNA 序列，又称为基因的体外扩增法。PCR 是生物芯片、测序等分子检测技术中的基础技术，也是一项独立的检测技术，对医学诊断等领域是革新式推动。
■ 原理及步骤
完成 PCR 过程的基本要素包括：
● DNA 模板：包含目标序列的样本 DNA
● DNA 聚合酶：合成与目标序列互补的新 DNA 链的酶，如TaqDNA 聚合酶
● 核苷酸：dNTP（A/T/C/G） 或脱氧核苷酸三磷酸，是构建新 DNA 链的元素
● 逆转录酶：在逆转录 PCR中需用逆转录酶将样品 RNA 转化为 cDNA
■ 类型
■ 实际应用
此类技术的实际应用场景极多，例如，对于类似于慢性骨髓性白血病等血液瘤，qPCR 技术可以通过检测原癌基因易位导致的 BCR/ABL 融合基因的表达，来确定微量残余肿瘤细胞的数量，进行治疗效果评估和复发预测。
通过使用带有突变特异性探针的 dPCR，可以在 cfDNA 中的某些突变开始出现在体液中时就检测到它们。此外，dPCR 的高精度和灵敏度可用于监测癌症进展和早期检测复发。
dPCR 除了可以检测点突变，还可用于检测 CNV。此外，研究显示， dPCR 检测 HPV 中 mRNA，对于组织学上无肿瘤的淋巴结中的隐匿性肿瘤细胞进行临床评估有较大的应用潜力。
3、下一代测序（NGS）
■ 定义
下一代测序（Next Generation Sequencing，NGS）也被称为大规模平行测序（MPS）或高通量测序（HTS），是一种大规模、并行、高通量测序技术，以可扩展性、快速和可及性等特点，来确定基因组或部分核酸（DNA/RNA）序列的排列顺序，进而分析对应调控、编码蛋白质等生物体特征。
■ 类型
从分类上，NGS 包括短读长测序及长读长测序，短读长测序在准确率及成本上相对成熟，广泛应用于基础研究及临床等应用，但因为读长短对于大片段结构变异及复杂基因组组装等方面有局限；
长读长测序目前主要应用于基础研究，临床应用仍在探索中，准确率及成本仍需优化，但很好弥补了 NGS 在长片段检测方面的局限。基因慧认为，在 5-10 年内，短读长和长读长将在市场上互补共存。未来随着技术迭代，极可能会出现集成 Sanger 测序、短读长和长读长优势的技术及工具出现。
■ 优势
NGS 在纳米级空间内进行 PCR 反应来扩增 DNA（ONT 等不需用到 PCR），基于大规模平行的反应产生巨大数据量。单位反应产生的数据量逐年提高，成本超摩尔定律下降，目前全基因组测序（30x）成本低于 500 美元。极大推动了人口级大规模基因测序基础研究，对于将基因技术应用到临床辅助诊断及伴随诊断、新药研发、病原溯源等作出了重要贡献。
此外，随着 PacBio 的 SMRT 技术优化，复杂物种以及微生物的 de novo 组装得以突破，推动生物多样性研究；ONT 的 Nanopore 测序技术不依赖 PCR，最长读长超过 4 Mb，结构变异检测日趋成熟；其便携式设备也让测序从实验室到野外，从地球到太空展开更广阔的应用场景。
■ 局限
尽管优势很大，NGS 仍存在不少局限性，例如：
● 在癌症液体活检仍需提高灵敏度，特别是低浓度样本和低频突变；
● 成本和周期仍需优化；
● 知识库的匮乏使得测序后序列难以解读，对应采取的临床基因 Panel 产品设计仍不够灵活和可扩展。
■ 实际应用
NGS 带来大量物种及大规模样本的基因组解析，进而与 IT 技术（生物信息、生物计算、机器学习）等结合，革新对癌症发展和进展的基础理解、临床应用以及治疗。目前，NGS已广泛应用于医学、公共卫生、农业、法医、生物多样性等方面的基础研究、辅助决策及分析。
4、免疫组化（IHC）
■ 定义及原理
免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）简称免疫组化，通过标记的特异性抗体在组织细胞原位结合目标抗原，通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，可视化相应抗原在细胞内及其适当的组织学背景的高分辨率分布和定位。
■ 步骤
通过切片机制作病理切片，与抗体一起培养。抗体结合位点与标记物（如荧光染料、酶、放射性元素或胶体金）相连，在显微镜下可视化。IHC 反应可以通过放射自显影来观察，核心是通过对细胞或组织造成最少的损伤来对大部分 IHC 进行染色，并通过使用最少的抗体，在肿瘤分型和肿瘤标志物上找到一条路。
■ 优势与实际应用
由于 IHC 涉及特定的抗原 - 抗体反应，且能够将抗原的存在与其在组织或细胞中的位置相关联，因此它比传统蛋白质检测方法具有明显优势。目前IHC是在临床上应用最为广泛的病理诊断技术，广泛应用于许多医学研究实验室和临床诊断，特别是细胞功能研究和分子病理检测。免疫组化检测可以诊断来源不明、原发灶和未知原发肿瘤转移的肿瘤，还可以预测乳腺癌和前列腺癌的治疗反应，并进行肿瘤的病理学分型，在肿瘤基础研究和临床应用上起到重要作用。
5、质谱分析（MS）
■ 定义及原理
质谱，即是使样本中各组分电离，生成不同荷质比的离子，经电场作用形成离子束进入质量分析器，不同质荷比的离子聚焦在不同的点上，得到质谱图，从而确定其质量进而进行组分的定性分析 ; 谱峰强度与化合物含量有关，据此进行定量分析。
■ 类型
质谱分为多种类型，包括气相色谱质谱联用仪（GC-MS）、液相色谱和串联质谱联用技术（LC-MS/MS）、串联质谱（MS-MS）、基质辅助激光解吸飞行时间质谱仪（MALDI-TOF MS）等。
■ 优势及实际应用
尽管目前常用技术可以高精度（即灵敏度和特异性）测量单个蛋白质，但由于与包括自身抗体在内的干扰物质（例如甲状腺球蛋白免疫测定）的交叉反应，某些蛋白质检测的特异性较低，通过 LC-MS/MS 进行免疫捕获分析可以消除干扰。基于液相色谱和串联质谱联用技术（LC-MS/MS）对蛋白质组进行高通量高深度研究，可获得蛋白质表达谱、蛋白质翻译后修饰、定量差异蛋白表达谱及蛋白质相互作用信息，应用于蛋白标志物发现、功能蛋白和多肽的挖掘、信号通路和分子机理机制研究等。
