精准清除衰老细胞，我国学者成功开发出智能抗衰策略！

发布于:细胞/干细胞 2023-02-07 3053

衰老是许多疾病发生的主要风险因素，包括癌症、心血管疾病、2型糖尿病、认知功能下降等。清除衰老细胞可以减缓衰老对机体的影响，并有望延长健康寿命。

手术切除老化组织目前被用作治疗部分由衰老细胞（SnCs）积累引起的疾病的方法，如运动功能障碍，但这种治疗仅限于部分组织老化并会给患者带来创伤和疼痛，因此最好的方法是使用抗衰老药物（senolytics）选择性地消除 SnC。

最近的明星抗衰老药物如槲皮素和雷帕霉素等，已被证明可以延缓衰老并改善与年龄相关的症状。然而，SnCs在体内表现出极大的异质性和动态性，导致这些senolytics在准确性、可控性和广谱活性方面存在显著的局限性。

尽管已经出现了解决这些问题的新策略，包括抑制谷氨酰胺分解和酶靶向前药，但目前为止还没有报道一种能够实现所有这些目标的智能抗衰老方案。

2023年2月2日，来自华东理工大学李剑教授和西北大学郭媛教授团队联合在NatureAging杂志发表题为“Photoactivatable senolysis with single-cell resolution delays aging”的文章，该文章整合了多种技术，将衰老相关 β-半乳糖苷酶 (SA-β-gal) 的酶底物与荧光标签相结合，并生成一种光敏性衰老前药KSL0608-Se，从而实现精准清除SnC。

研究人员首先设计一种由 SA-β-gal 激活的光敏性衰老清除剂，SA-β-gal 是一种在 SnC 中特有且广泛存在的酶，设计这种 senolytic 前药的目的是确保将光敏药物能准确地输送到 SnC中。

合成从修饰具有良好供体-π-受体 (D-π-A) 特性的基于二氰亚甲基-4H-吡喃的骨架和调节电子供体能力的酚基开始，然后经过一系列步骤，产生光敏前药KSL0608-Se。该前药在被 SA-β-gal 特异性水解后立即通过 2-氟甲基苯酚中间体转化为生物正交醌-甲基化物受体。这种受体的独特之处在于它可以共价连接到附近的蛋白质，并在 SnC 中选择性地原位产生光敏药物。基于相同的设计策略，研究人员又合成了一种用 O 代替 Se 的自固定 SA-β-gal 荧光探针KSL0608-O。

在细胞成像之前，研究人员对化合物KSL0608-Se和KSL0608-O的细胞毒性进行了评估，两种化合物均表现出低细胞毒性。将具有高内源性 β-gal 水平的人卵巢癌细胞 (SKOV3) 和含有低内源性 β-gal 的人肝癌细胞 (HepG2) 分别与化合物一起孵育。

在 SKOV3 细胞中观察到明显的 NIR 荧光信号，而在 HepG2 细胞中没有出现明显的荧光信号。D-半乳糖和苯乙基 β-D-硫代吡喃半乳糖苷 (PETG) 这两种 β-gal 抑制剂被用于降低细胞中β-gal 的活性。正如预期的那样，在用每种抑制剂处理后，SKOV3 细胞与KSL0608-O/ KSL0608-Se一起孵育，结果发现NIR 通道中的荧光均减弱，支持这两种化合物检测活细胞内源性 β-gal 的特异性。

然后，研究人员评估了它们检测衰老正常细胞和衰老癌细胞中 β-gal 活性的能力，包括人肺成纤维细胞、大鼠肾小管上皮细胞、人类衰老表型的小肺癌细胞和正常人肝细胞。这种具有 DNA 损伤的 SnC 是通过用 ROS 刺激 NRK-52E、丝裂霉素 C (MitoC) 刺激 A549 和 doxo 刺激 HL-7702 获得的。在与KSL0608-O或KSL0608-Se孵育后，所有 SnC 均发出比相应的具有低表达 β-gal 的年轻细胞更强的 NIR 荧光。年轻细胞和 SnCs 的 p21 和 p53 的 X-gal 染色和蛋白质印迹分析结果与上述结果非常一致。这些结果证实，这两种化合物都可以检测活细胞中的 SA-β-gal。

为了进一步验证KSL0608-O和KSL0608-Se对SnCs的特异性，研究人员构建了SnCs与年轻细胞的共培养体系，其中年轻细胞预先用绿色荧光标记，然后与SnCs共培养。年轻细胞在 NIR 通道中显示出可忽略的微弱荧光，而 SnCs 显示出明亮的 NIR 荧光，实现了 SnCs 的特异性标记。

随后科研人员想研究这两种化合物在该共培养系统中特异性杀死 SnC 的能力，共培养细胞用KSL0608-Se处理伴随着照射，更衰老的MRC-5细胞（P40）表现出显著的细胞皱缩和形态学变化，这是细胞凋亡的特征。当使用KSL0608-O代替KSL0608-Se时，P28 MRC-5 细胞和 P40 MRC-5 细胞的细胞形状都没有发生变化。

这些结果表明，这两种化合物都具有识别和靶向 SnC 的能力，而KSL0608-Se具有独特的选择性杀死 SnC 的能力。此外，在与KSL0608-O或KSL0608-Se孵育的衰老 HL-7702 细胞中，在宽分子量范围内观察到多个荧光带，说明 NIR 发射产物已形成并成功锚定到 SnC 中的多种蛋白质。

探针KSL0608-O在与KSL0608-Se几乎相同波长的光的激发下可以被激活，然后发出明亮的荧光。这也就使得在小鼠体内荧光成像实验中使用KSL0608-O来验证KSL0608-Se介导的可控光动力疗法(PDT )中使用的照射光对实体器官的穿透能力。

随着时间的推移，老年小鼠腹部的荧光强度逐渐增加，并在 96 h 时达到最大值，而年轻小鼠的荧光强度可忽略不计，支持KSL0608-O的靶向激活在老年小鼠中。此外，老龄小鼠肝脏、肺和肾脏的荧光强度强于年轻小鼠，而老龄和年轻小鼠的心脏和脾脏荧光信号可忽略不计，表明衰老主要发生在这些老年小鼠的肝脏、肺和肾脏中。这些结果表明，KSL0608-Se介导的PDT中使用的照射光具有穿透组织的能力。

研究人员接下来想了解KSL0608-Se在体内对年龄相关病理的 PDT 效果，评估了 γ-组蛋白 2AX (γ-H2AX) 的表达水平，这是一种公认的年龄相关标志物。结果表明，治疗降低了老龄小鼠肝脏和肾脏中γ-H2AX的表达，血清生化测试表明，衰老导致的天冬氨酸氨基转移酶 (AST) 和丙氨酸氨基转移酶 (ALT) 作为年龄相关指标上调被抵消了。

此外，用KSL0608-Se进行的 PDT 治疗显著降低了p21和IL-1β这两种衰老标志物的表达水平。与该观察结果一致，通过 X-gal 和KSL0608-O染色检测到的 SA-β-gal 表达水平表明，在KSL0608-Se介导的 PDT后，老年小鼠肾脏中的 SnC 明显减少。这些结果表明实验方案可以有效地去除 SnCs 以抑制老年小鼠中不同年龄相关标志物的上调。