肿瘤对凋亡的抵抗和免疫抑制的肿瘤微环境是肿瘤治疗反应差的两个主要原因。细胞焦亡是一种不同于细胞凋亡的溶解性和炎症性程序性细胞死亡途径，最新的证据表明，肿瘤细胞中的细胞焦亡诱导导致强烈的炎症反应和显著的肿瘤消退。
作为其抗肿瘤作用的基础，细胞焦亡是由促进孔隙形成的gasdermin蛋白介导的，该蛋白通过释放促炎细胞因子和细胞破裂后的免疫原性物质促进免疫细胞活化和浸润。然而，考虑到其炎症性质，异常性的细胞焦亡也可能与肿瘤支持性微环境的形成有关。因此，深入了解细胞焦亡的分子途径，理清细胞焦亡与癌症之间复杂的联系，有助于我们充分利用细胞焦亡，并将其应用于现有的或新的抗癌策略。
01
细胞焦亡
上世纪90年代，在感染鼠伤寒沙门氏菌（S.typhurium）和福氏沙门氏菌的巨噬细胞中首次描述了细胞焦亡。虽然最初被认为是一个凋亡过程，但进一步的研究表明，这种细菌诱导的细胞死亡严重依赖于caspase-1。焦亡细胞与凋亡细胞有一些共同特征，如染色质浓缩和DNA断裂，但可通过其完整的细胞核、孔隙形成、细胞肿胀和渗透溶解来区分。
通常，焦亡细胞破裂是通过结合损伤相关分子模式（DAMP）或病原体相关分子模式（PAMP）后，通过半胱氨酸蛋白酶介导的成孔GSDM蛋白活化实现的。这些相同的半胱氨酸蛋白酶也可能直接或间接促进促炎细胞因子的成熟，这些促炎细胞因子与DAMP一起，在释放时启动或维持炎症反应。
虽然细胞焦亡在病原体分解中起着重要的保护作用，但它已被认为是几种人类疾病的复杂因素，如心血管疾病、神经退行性疾病和艾滋病。糖尿病等代谢紊乱也可能通过慢性炎症和胰岛素干扰性细胞因子的产生而促进细胞焦亡。在癌症中，细胞焦亡的作用似乎是把双刃剑。一方面，细胞焦亡可迅速导致肿瘤消退，另一方面，它可促进肿瘤微环境的发展。因此，癌细胞可能抑制或刺激细胞焦亡，以支持其进展，具体取决于环境。
02
细胞焦亡的分子机制
尽管已知的细胞焦亡途径的数量在未来可能会增加，但目前已有两条主要途径和几种替代途径被阐明。在主要途径中，细胞焦亡是由GSDMD诱导的，涉及炎症性caspase-1（经典途径）或caspase-4/5（非经典途径）。在替代途径中，最受广泛关注的是GSDME通过caspase-3诱导的细胞焦亡。
经典炎症小体途径
在经典的炎性小体途径中，模式识别受体（PRR）识别DAMP（例如纤维蛋白原、热休克蛋白、DNA）和/或PAMP（例如鞭毛蛋白、聚糖、脂多糖）导致被称为炎性小体的相应胞质信号复合物的激活，通常由传感器蛋白、适配器和效应器半胱氨酸蛋白酶组成。
尽管多种PRR，如NLR和TLR参与了这一过程，但已知其中只有部分能够直接组装炎症小体并激活半胱氨酸蛋白酶caspase-1。具体而言，该亚群中的PRRs/炎症小体传感器包括NLR家族的NLRP1、NLRP3、NLRP4、AIM2和pyrin。激活后，这些传感器中的大多数与适配蛋白ASC相互作用，后者通过前半胱氨酸蛋白酶-1的募集和切割激活caspase-1。除了释放和激活GSDMD的致死N端结构域（GSDMD-N），caspase-1还使前IL-1β和前IL-18成熟为IL-1β和IL-18，它们通过GSDMD-N形成的坏死膜孔释放。
非经典炎症小体途径
与标准炎症小体途径相反，非标准炎症小体途径不依赖caspase-1，而是依赖于caspase-4和caspase-5以及小鼠的caspase-11。这些半胱氨酸蛋白酶的激活是通过LPS与相应的前半胱氨酸蛋白酶的直接结合发生的，并且绕过了炎症小体传感器。尽管这些半胱氨酸蛋白酶不直接激活IL-1β和IL-18，但它们通过GSDMD裂解触发细胞焦亡导致钾离子外流，从而激活NLRP3炎症小体并上调caspase-1的作用。
替代途径
研究表明，在某些情况下，如化疗或靶向癌症治疗，可通过caspase-3诱导凋亡到焦亡的途径。尽管caspases-3主要与凋亡执行和形态学改变有关，但它可以通过切割GSDME介导细胞焦亡，这同样导致GSDME-N孔的形成和膜的通透性改变。当GSDME水平较高时，caspase-3激活后会迅速引发细胞焦亡，但当GSDME水平较低时，则会引发凋亡。然而，这一概念仍需要进一步的验证。
此外，还有其他几种替代性细胞焦亡途径，包括caspase-8对GSDMD的切割；caspase-8或颗粒酶B（GzmB）对GSDME的切割；caspase-1或颗粒酶A（GzmA）对GSDMB的切割；通过caspase-8切割GSDMC，GSDMC通过缺氧激活的程序性死亡配体1（PD-L1）和pSTAT3转录上调以及其它未知机制形成的GSDMA孔。
03
癌症中的细胞焦亡及其成分
细胞焦亡在癌症中的模糊作用似乎与细胞类型、遗传学和诱导持续时间有关。在异常表达和延长活性后，GSDM、炎症小体和/或促炎细胞因子可通过诱导免疫抑制细胞、促进上皮细胞向间质细胞转化以及上调基质金属蛋白酶以进行细胞外基质重塑来促进肿瘤病理学。另一方面，与这些效应并列，细胞焦亡也可以抑制肿瘤，例如，在肝细胞癌模型中，通过NLRP3炎性小体激活诱导的细胞焦亡显著抑制了肿瘤的转移和生长。
鉴于细胞焦亡的双重作用，其分子成分在不同癌症中存在差异表达。GSDMs在乳腺癌、胃癌、宫颈癌和肺癌等肿瘤中，已被证明同时作为癌基因或肿瘤抑制因子控制增殖、转移、治疗抵抗和抗肿瘤免疫。
在胃癌（GC）中，GSDMD表达显著降低，并导致体外和体内肿瘤增殖增强。相反，非小细胞肺癌（NSCLC）中的GSDMD蛋白水平显著升高，并且与肿瘤转移以及更差的预后相关。与GSDMD类似，GSDME在胃癌、乳腺癌和大肠癌中的表达也降低。GSDMC在大肠癌中表达明显上调，在大肠癌中，GSDMC在体外促进了癌变和增殖，在体内促进了肿瘤生长。GSDMB水平越高，乳腺癌患者的转移率越高，生存率越低。
在其他细胞焦亡成分中，观察到大多数结直肠癌肿瘤中AIM2表达显著降低或缺失，且与患者预后不良有关。NLRP1水平在大肠癌肿瘤组织中同样降低，并与转移增加和生存率降低有关。乳腺癌患者组织中的caspase-1 mRNA水平显著降低，此外，caspase-1的缺失与前列腺癌和大肠癌的肿瘤发生有关。
阐明细胞焦亡与癌症之间的关系需要更广泛的研究。一个面临的挑战将是识别每种细胞焦亡分子成分的肿瘤特异性作用。由于多条通路导致细胞焦亡，且多个成分重叠，因此，表征每条通路的整体肿瘤特异性效应，而不是每个成分的个体效应，可能是理解和/或预测肿瘤对细胞焦亡调节的更有效策略。
04
细胞焦亡与抗肿瘤免疫的关系
细胞死亡引发适应性免疫反应的能力称为免疫原性细胞死亡（ICD）。与基本上是免疫耐受过程的凋亡不同，细胞焦亡具有诱导强烈炎症反应的分子机制，在某些情况下被认为是ICD的一种形式。虽然细胞焦亡与抗癌免疫之间的联系尚不清楚，但越来越多的研究表明，细胞焦亡介导的肿瘤清除是通过增强免疫激活和功能实现的。
GSDMA
研究发现，将GSDMA的小鼠亚型Gsdma3选择性地递送到人类HeLa、小鼠EMT6和小鼠4T1癌细胞，导致20-40%的细胞发生细胞焦亡。在体内模型中，通过静脉或瘤内注射NP–Gsdma3进行三轮治疗，导致肿瘤明显缩小。与PBS对照组相比，NP–Gsdma3治疗的肿瘤中CD4+、CD8+、自然杀伤（NK）和M1巨噬细胞数量增加，但单核细胞、中性粒细胞、髓源性抑制细胞和M2巨噬细胞的数量减少。此外，除了在血清和肿瘤水平IL-1β、IL-18和HMGB1水平增加外，还发现许多免疫刺激和抗肿瘤效应基因（如Cd69、Gzma、Gzmb）的上调，各种免疫抑制和肿瘤前体基因（如Csf1、Vegfa、Cd274）下调。
GSDMD
通过研究CTLs在肺鳞状细胞癌（LUSC）和黑色素瘤肿瘤样本中与CD8+T细胞标记物有关的GSDM基因的表达，发现在五个GSDM基因成员中，只有GSDMD表达与CTL中的CD8+T细胞标记基因（例如CD8A、CD8B、PRF1、GZMA、GZMB和IFNG）呈正相关。进一步研究表明，与原始T淋巴细胞相比，OT-1小鼠活化的CTL中GSDMD的表达显著增加。类似地，人CD8+T细胞在激活后上调GSDMD，肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）中可见高水平的GSDMD蛋白。
此外，GSDMD敲除后，CTL对3LL-OVA细胞的细胞毒性降低。使用人CTL和H1299非小细胞肺癌细胞系记录了类似的结果。考虑到CTL杀死肿瘤细胞的一个关键途径是通过将细胞毒性分子释放到它们形成的免疫突触中，推测GSDMD和GzmB进入效应癌细胞可能是研究中发现的CTL细胞毒性的潜在机制。
GSDMB
GSDMB介导细胞焦亡与GzmA密切相关。在HEK-293F细胞中的五种人类颗粒酶中，发现只有GzmA以类似于NK细胞杀伤试验的模式快速切割GSDMB。当GzmA电穿孔到GSDMB重组的293T细胞中时，引起广泛的GSDMB裂解和细胞焦亡。同样，在生理条件下，GzmA介导的GSDMB切割在NK细胞杀伤293细胞时也是必需的。
值得注意的是，其他GSDMB水平不明显的癌细胞系，如OE33（食管癌细胞）和HCC1954（乳腺癌细胞），可通过暴露于通常由活化的CTL释放的细胞因子（如IFN-γ和TNF-α）来转录诱导GSDMB表达增加。反过来，IFN-γ启动显著增强了这些细胞系的细胞焦亡，这种效应最终取决于GzmA。
总之，这些发现不仅表明GSDMB介导的细胞焦亡作用于GzmA下游，而且细胞毒性淋巴细胞可将GzmA传递到表达GSDMB的癌细胞中，以促进抗肿瘤免疫。
GSDME
研究发现，GSDME介导的细胞焦亡与GzmB相关。在小鼠4T1E乳腺癌细胞中异位表达小鼠GSDME（mGSDME），在体内模型中可显著抑制4T1E肿瘤生长，并导致NK细胞和肿瘤相关巨噬细胞（TAM）浸润增加。此外，当受到刺激时，肿瘤中表达GzmB和穿孔素的NK细胞和CD8+TIL增加。
进一步研究表明，人NK细胞系YT可以激活表达GSDME的HeLa细胞中的细胞焦亡，这种诱导是通过GzmB实现的，它不仅在与caspase-3相同的位置切割GSDME，而且间接激活caspase-3。
此外，CAR-T细胞可以通过穿孔素和GzmB释放，在B细胞白血病和实体瘤细胞中诱导GSDME介导的肿瘤细胞的细胞焦亡。用共同培养的CD19-CAR-T细胞和癌细胞（NALM-6、Raji或原发性B白血病细胞）的上清液处理人源性巨噬细胞，可促进巨噬细胞激活caspase-1，切割GSDMD，并释放IL-6和IL-1β。同时发现共培养上清液中的ATP和HMGB1分别足以促进巨噬细胞IL-1β分泌和IL-6上调。总的来说，这些发现表明CAR-T细胞治疗通过GSDME促进的细胞焦亡诱发CRS，对CD19-CART细胞治疗前患者的肿瘤细胞进行分析，显示GSDME水平升高与更严重的CRS相关。
05
细胞焦亡在抗癌治疗中的应用前景
近年来，越来越多的研究表明，利用细胞焦亡通过不同的靶向和传递方法进行抗肿瘤免疫的可行性和治疗潜力。
例如，利用肿瘤细胞衍生微粒（TMP）将甲氨蝶呤注入胆管癌（CCA）细胞，以诱导GSDME介导的细胞焦亡，从而激活患者衍生的巨噬细胞，并将中性粒细胞募集到肿瘤部位进行药物导向的肿瘤破坏。此外，当这种甲氨蝶呤TMP输送系统注入肝外CCA患者的胆管管腔时，25%的患者观察到中性粒细胞活化和胆道梗阻的缓解。
此外，还发现GSDME介导的细胞焦亡通过BRAF和MEK抑制剂的组合在黑色素瘤中引起免疫细胞浸润/激活，并导致黑色素瘤消退。在另一种策略中，二甲双胍是治疗2型糖尿病最常用的药物，其可以通过caspase-3间接激活细胞焦亡来抑制癌细胞增殖。
一系列针对KRAS、EGFR或ALK突变型肺癌的小分子抑制剂也被发现，在线粒体固有凋亡途径激活后，通过caspase-3介导的GSDME裂解诱导细胞焦亡。在乳腺癌细胞中，用RIG-1激动剂治疗可触发外源性凋亡途径和细胞焦亡，激活STAT1和NF-κB并上调淋巴细胞募集趋化因子。因此，在小鼠中RIG-1激活后，乳腺癌转移和肿瘤生长的减少伴随着肿瘤淋巴细胞的增加。
几乎所有抗癌免疫治疗策略面临的另一个主要障碍是免疫抑制肿瘤微环境引起的失调。为了解决这个问题，Lu等人设计了含有嵌合共刺激转化受体（CCCR）的NK92细胞，该受体将抑制性PD-1信号转化为激活信号，有效地增强了抗肿瘤活性。在体外，CCCR-NK92细胞通过GSDME介导的细胞焦亡迅速杀死H1299细胞，在体内显著抑制肿瘤生长。
此外，越来越多令人兴奋的研究报告表明，细胞焦亡诱导与PD-1抑制剂协同作用使肿瘤由“冷”变“热”，表明这种组合的巨大潜力。
06
小结
作为一种炎性细胞死亡模式，细胞焦亡通过激发抗肿瘤免疫反应而在肿瘤抑制中发挥重要作用。在某些情况下，单纯的细胞焦亡诱导就可能足以阻碍肿瘤生长。然而，细胞焦亡治疗应用面临的最大挑战之一是细胞焦亡相关成分的表达和功能的不规则性，不仅在不同的癌症之间，而且还存在于同一类型的癌症中。尽管如此，分子、遗传和表观遗传靶向/递送系统的进步，以及精准和个性化的医学的发展，让我们有希望很快能够利用这些强大机制作为治疗癌症的工具。
参考文献：
1.Pyroptosis at the forefront of anticancerimmunity. J Exp Clin Cancer Res. 2021; 40: 264.
