蛋白质作为基因功能的执行者，从理论上说，只要是发病机制清晰、病理学靶点明确的疾病，蛋白质药物几乎都可以胜任。随着基因克隆、DNA重组等生物技术体系以及蛋白质组学、代谢组学等生物信息学的不断成熟完善，蛋白质药物，尤其是重组蛋白、工程化抗体等药物获得了蓬勃的发展。
蛋白质药物的生产通常涉及基因克隆、细胞培养、分离纯化、修饰和结构验证、储存包装等步骤。由于大多数蛋白质药物产生自大型生物反应器中的活细胞（如酵母），如何将蛋白质从反应器中分离出来就成为了整个流程中最为关键的步骤之一，也是较为困难的环节之一。
色谱法通常是这一步所采用的方法。该方法利用化学物质在固定相和移动相之间不同的亲和性或分配行为来实现混合物中化合物的分离。然而，色谱法需要用到一些非常昂贵的材料，导致蛋白质分离纯化这一步所需的成本高达制造全过程的50%。这将大大降低蛋白质药物尤其是在发展中国家的可及性。
为此，麻省理工学院机械工程教授Kripa Varanasi及其团队希望找到一种方法，能将这一步的成本压缩。他们将目光投向了蛋白质结晶。
蛋白质结晶是科研人员用于研究蛋白质结构的常用方法，不过将这种方法运用于工业规模生产则存在着一系列的缺点：首先，蛋白质结晶的速度非常慢，即使在最佳条件下，生长蛋白质晶体也可能需要数天甚至数周时间；其次，蛋白质结晶对浓度具有极高的要求，通常需要2-100mg/mL，而生物反应器中的蛋白质浓度通常在5-20g/L。
为了解决上述挑战，Varanasi团队通过改造纳米级结构来实现蛋白质浓度的局部提升，同时提供一个模板，让蛋白质能够正确排列并形成晶体。相关研究成果以“Enhancing Protein Crystal Nucleation Using In Situ Templating on Bioconjugate-Functionalized Nanoparticles and Machine Learning”为题发表于ACS Applied Materials & Interfaces。
图1 研究成果（图源：[1]）
研究人员使用一种叫做生物轭合物（Bioconjugate）的分子修饰金纳米粒子。生物轭合物能够与特定的氨基酸反应，以往常在蛋白质和细胞研究中用于标记蛋白质，或在药物输送中将蛋白质附着到纳米粒子上。在该实验中，研究人员使用了马来酰亚胺（maleimide，MAL）和N-羟基琥珀酰亚胺酯（N-hydroxysuccinimide ester，NHS）这两种生物轭合物，前者能够与半胱氨酸中的硫醇基反应，后者能够与赖氨酸中的伯胺或蛋白质的N端反应。
纳米粒子被生物轭合物修饰后，表面形成了共价键合的蛋白质模板。模板能够使得溶液中的蛋白质积聚在纳米粒子的表面，并以特定的方向排列，为后续蛋白提供加入的支架，从而加速结晶过程。
研究人员选择溶菌酶和胰岛素这两种蛋白质结构、结晶特性已得到充分探索的蛋白质来评估该结晶方法的效率。结果发现，与裸露的纳米粒子或没有纳米粒子相比，当蛋白质暴露于涂有生物轭合物的纳米粒子时，结晶发生的速度要快得多。其中，结晶从零到开始形成所需的时间，即诱导时间，减少了七倍；结晶一旦形成后的生长速度，即成核速率，提升了三倍。
图2 在涂有生物轭合物（上）的纳米粒子上，蛋白质晶体的形成速度更快（图源：[1]）
研究的第一作者、麻省理工学院研究生Caroline McCue表示：“即使在低蛋白质浓度下，我们也会看到更多的晶体伴随这些涂有生物轭合物的纳米粒子生成。被生物轭合物功能化的纳米粒子大大减少了诱导时间，因为生物轭合物的存在，蛋白质有了特定的结合位点，且因为排列整齐，蛋白质能更快地形成晶体。”
虽然该实验仅针对溶菌酶和胰岛素展开，但Varanasi教授认为：“这是一种可以拓展到其他系统的通用方法，只要你知道蛋白质的结构，你就可以添加对应的生物轭合物来促使结晶过程的发生。”
此外，研究团队还使用机器学习分析了数以千张的晶体图像。“蛋白质结晶是一个随机过程，因此我们需要一个庞大的数据集才能真正评估我们的方法是否正在改善结晶的诱导时间和成核率。”McCue说。
该研究团队正致力于将这一快速结晶过程推广到更多场景，使之能够真正运用于工业的生物反应器，并该方法对于单克隆抗体、疫苗和其他有用的蛋白质同样有效。
“如果我们能让蛋白质制造在任何地区都变得容易，那么世界上每个人都可以受益，”Varanasi 说。“即使不是明天就可以解决这个问题，但这也是为实现这一愿景而迈出的一小步。”
参考资料：
[1]Caroline McCue, Henri-Louis Girard, Kripa K. Varanasi. Enhancing Protein Crystal Nucleation Using In Situ Templating on Bioconjugate-Functionalized Nanoparticles and Machine Learning. ACS Applied Materials & Interfaces, 2023; DOI: 10.1021/acsami.2c17208
