哈佛医学院、缅因大学和麻省理工学院的科学家们发表在《Aging》上的一项开创性研究提出用化学方法将老化细胞部分重编程到更年轻的状态，但不改变分化细胞身份（不用到ipsc），为逆转衰老提供了另一种方案，将在再生医学、治疗与年龄有关的疾病和全身年轻化方面具有应用前景。
真核生物衰老的一个标志是表观遗传信息的丢失，这个过程是可以逆转的。此前已经证明，在哺乳动物中异位诱导“山中因子”——OCT4、SOX2和KLF4 (OSK)可以让分化细胞恢复年轻时的DNA甲基化模式、转录图谱和组织功能，而不会消除细胞身份，这一过程需要活跃的DNA去甲基化。为了筛选在不改变基因组的情况下逆转细胞衰老并使人类细胞恢复活力的分子，来自哈佛医学院、缅因大学和麻省理工学院的科学家们开发了一种化学方法，可以将细胞重新编程到更年轻的状态但不改变分化细胞的类型，这项技术为逆转衰老提供了有别于基因治疗的潜在替代方案。
他们首先开发了一种用于区分年轻细胞、年老细胞和衰老细胞的高通量细胞检测方法——包括基于转录的衰老时钟（transcription-based aging clocks）和实时细胞核胞质区隔分析（real-time nucleocytoplasmic compartmentalization (NCC) assay。然后确定了六种化学试剂鸡尾酒，可在不到一周的时间内，在不逆转细胞身份的情况下，恢复了年轻的全基因组转录谱，逆转了转录组年龄。结果表明，年龄逆转的返老还童不仅可以通过基因，还可以通过化学手段实现。这项研究的意义是巨大的，在再生医学、治疗与年龄有关的疾病和全身年轻化方面具有潜在的应用。这篇论文的标题是“化学诱导重编程逆转细胞衰老” ，2023年7月12日发表在《Aging》杂志上。
iPSCs另一个方向的探索
这一发现建立在一项发现的基础上，即被称为Yamanaka因子的特定基因的表达可以将成人细胞转化为诱导多能干细胞(iPSCs)。这项获得诺贝尔奖的突破促使科学家们设想，是否可以在不使细胞变得太年轻和可能癌变的情况下逆转细胞衰老。
在真核生物中，有两个主要的信息库：基因组和表观基因组。尽管这些信息库相互依赖地协调生命分子机器的生产和运作，但它们在基本方面是不同的。遗传信息是数字化的，并且在人的一生中，在身体的所有细胞中基本保持一致。相比之下，表观遗传信息是由一个不太稳定的数字模拟系统编码的，在细胞之间变化，并随着环境和时间的变化而变化。
已知至少有12种“衰老标志”会导致细胞随着年龄增长而退化和功能障碍。从酵母到哺乳动物，已经有令人信服的证据支持：表观遗传信息的丧失，会导致基因表达的变化，引发一系列事件，包括线粒体功能障碍、炎症和细胞衰老，导致细胞和组织功能的逐步下降，表现为衰老和与年龄相关的疾病。此前在小鼠身上的研究表明，细胞损伤，如DNA双链断裂和细胞破碎，会促进表观遗传信息的丢失，从而导致衰老和与年龄相关的疾病的加速。细胞衰老是一种永久性的细胞周期停滞状态，通过停止衰老和受损细胞的增殖来促进伤口修复、组织重塑和避免癌症。衰老与细胞形态、染色质结构的改变和炎症因子的释放有关，这一过程被称为衰老相关分泌表型(SASP)。向细胞衰老的转变可以由表观遗传信息的丢失、端粒缩短、不可修复的DNA损伤和细胞质DNA引起。
2006年，Takahashi和Yamanaka证明了OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC(统称为“OSKM”)这四种转录因子的表达对成体细胞的发育潜能进行重编程，使其能够转化为各种细胞类型。这些发现开启了细胞重编程领域，一系列发表文章表明来自不同物种的许多不同类型的成年细胞的身份可以被清除，成为诱导多能干细胞，通常称为“iPSCs”。针对Yamanaka因子消除细胞特性的能力，人们提出了一个关键问题：是否有可能在不引起细胞生长不受控制和肿瘤发生的情况下逆转体内细胞衰老？实验证实，通过脉冲OSKM表达或通过持续只表达OSK，而不表达致癌基因c-MYC，可以安全地改善体内组织的功能。例如，在视神经中，三个Yamanaka因子组合的表达可以安全地重置DNA甲基化组和基因表达模式，通过一个很大程度上尚不清楚的机制来改善老年和青光眼小鼠的视力，该机制需要TET DNA去甲基化酶。许多组织，包括脑组织、肾脏和肌肉，现在已经能被重新编程而不会导致癌症。事实上，OSK在小鼠全身的表达可以延长其寿命。这些结果与年轻表观基因组的“备份拷贝”的存在是一致的，它可以通过部分重编程来重置以恢复组织功能，而不会消除细胞身份或导致肿瘤发生。
衰老是人类疾病和痛苦的最大贡献者。目前旨在逆转衰老、治疗损伤和治愈与年龄有关的疾病的转化应用都依赖于将遗传物质输送到目标组织。这是通过腺相关病毒(AAV)递送DNA和脂质纳米颗粒介导的RNA递送等方法实现的。这些方法面临着广泛使用的潜在障碍，包括高成本和与将遗传物质引入人体有关的安全问题。开发一种化学替代品来模拟OSK的返老还老作用，可以降低成本，缩短再生医学开发的时间。这一进步可能使各种医疗条件的治疗成为可能，甚至可能促进全身年轻化。
哈佛医学院的研究人员开发并利用了新的筛选方法，包括定量细胞核质区隔分析(NCC)，可以很容易地区分年轻、年老和衰老细胞。他们发现了多种新的化学混合物，能够使细胞恢复活力，逆转转录组年龄，其程度与OSK过表达相似。因此，使用化学手段而不是遗传手段且不消除细胞特性，有可能逆转衰老的各个方面。
建立区分细胞年龄的高通量方法
为了高效识别出能逆转衰老和影响衰老的小分子，作者首先开发了一种基于荧光的，评估细胞年龄的方法，可以通过自动显微镜在每个实验中对数百万个细胞进行定量，作为细胞健康和年轻基因表达模式的标志。
衰老最保守的生理标志之一是核胞质区隔化(NCC)的降低，这可以可视化为核蛋白渗漏到细胞质中，蛋白质无法输入细胞核。在老年人成纤维细胞直接转化的神经元和星形胶质细胞，以及老年线虫和大鼠脑组织中，核孔通透性和胞质蛋白聚集增加。衰老可以通过多种方式诱导，包括端粒侵蚀、癌基因表达和DNA损伤。由于复制性衰老会推进DNA甲基化时钟，而DNA损伤诱导的衰老则不会，选择复制性衰老细胞可能比其他诱导类型的衰老细胞更可靠地找到表观遗传逆转年龄的方法。
为了监测与年龄相关的核通透性改变，作者构建了NCC报告系统：其中mCherry与核定位信号(NLS)相连，eGFP和核输出信号(NES)相连。在健康的年轻成纤维细胞（来自22岁正常供体）中，这些蛋白的细胞定位明显分离，而在来自94岁供体或14岁Hutchinson-Gilford早衰综合征(HGPS)患者的成纤维细胞中，细胞质中mCherry点的数量和强度高于来自22岁正常供体的成纤维细胞。
为了避免由于衰老细胞中一小部分具有复制能力的细胞扩增而导致的意外的假年轻化效应，所有实验都是在完全抑制细胞分裂的低血清条件下进行的。在非衰老、静止的对照成纤维细胞中，mCherry和eGFP信号可以清晰区分。衰老成纤维细胞通过传代~40次生成，直到完全没有生长两周，衰老细胞的形态学改变，细胞周期调节因子p21 (CDKN1A)的转录物急剧增加，以及其他衰老相关的基因表达变化。在衰老成纤维细胞中，mCherry聚集在细胞质中，并与eGFP共定位，这与先前的报道一致。通过Pearson相关性测量，信号的共定位在复制性衰老细胞中明显高于静止细胞。这些实验表明，NCC系统可以从复制性衰老细胞中识别非衰老细胞，基本上是实时的。
基因本体(Gene ontology, GO)分析表明，上调基因的前20个GO生物学过程包含衰老的关键特征，包括发育、定位和运输失调，其中11个被OSK逆转。尽管在所有条件下都没有细胞分裂，但衰老引起了细胞周期基因mRNA水平的微妙但显著的变化，包括p21 。衰老导致许多细胞周期相关过程中表达下调基因，前20个过程中有19个被OSK表达逆转。这一研究的最终结果是证明OSK的诱导部分抵消了衰老引起的衰老相关变化。
使用NCC报告系统，作者检测了细胞从静止过渡到衰老时核细胞质完整性的退化，以及OSK处理对这些衰老细胞的恢复作用。
1，与静止细胞相比，衰老细胞的mCherry和eGFP聚集显著增加，表明核细胞质完整性被破坏。
2，OSK处理4天后，衰老细胞的NCC完整性显著恢复，与静止的非衰老细胞群相当。
综上所述，这些数据表明，OSK介导的表观遗传重编程实质上逆转了衰老相关的病理和转录组学变化，NCC报告系统可以通过OSK检测衰老细胞的年轻化。
通过重编程小分子逆转衰老相关的NCC变化
为了鉴定能够使衰老细胞恢复活力的小分子，作者整理了一份分子清单——这些分子已知能成功地将人类和小鼠体细胞重编程为化学诱导的多能干细胞(CiPSCs)，并使用NCC试验对它们进行了测试。使用完全衰老的细胞来避免检测由于细胞周期或向衰老过渡而引起的变化。已知表观遗传年龄逆转发生在OSK (M)介导的重编程后一周内，表观遗传年龄持续下降直到出现多能性，接近零年龄。为了确保一致性，实验控制在OSK所需的四天时间内，对细胞进行了各种小分子组合测试。
为了在不改变细胞特性的情况下实现年龄的降低，作者将重点放在了可能在CiPSC形成早期起作用的小分子上，包括丙戊酸(V)、CHIR-99021 (C)、E-616452(6)、丙基环丙氨酸(T)和福斯可林(F)。由于已知小鼠和人类之间的分化存在差异，作者还研究了已报道的产生人类CiPSCs的起始状态的分子，包括CHIR-99021 (C)、E-616452(6)、TTNPB (N)、Y-27632 (Y)、Smoothened Agonist (S)和ABT-869 (A)。配方VC6TF(C1)和C6NYSA(C4)被用作基础重编程鸡尾酒，并补充了其他已知可以提高iPSC效率的助剂，包括丁酸钠、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和α酮戊二酸(α-KG)。
在NCC试验中测试的80种鸡尾酒中，VC6TF基础鸡尾酒在恢复核胞质区隔的完整性方面最有效，这是年龄逆转的关键标志。作者选择了六种小分子配方进行进一步的研究，其中三种是基于C1和两种添加剂(称为C2和C3)，另外三种是基于鸡尾酒4加上额外的添加剂(称为C5和C6)。丁酸钠是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂，是人类和小鼠鸡尾酒C中最有效的添加剂之一(C2和C5中添加)。C3采用碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，C6采用α-KG。为了更好地衡量这些化合物对NCC完整性的影响，使用Pearson相C关性来评估荧C光蛋白的分布。结果表明，六种鸡尾酒配方在统计学上显著改善了衰老细胞的区隔化，可以使NCC和全基因组转录谱恢复到年轻状态，在不到一周的时间内逆转转录组年龄。另外实验还增加了添加染色质重塑因子的抑制剂，以研究这些因子是否代表了恢复活力的障碍或基本驱动因素。
化学介导部分重编程，而不是将细胞完全重置为多能性
为改善NCC完整性，采用RNA-seq来评估这六种鸡尾酒对转录组年龄的影响，结果表明：
1.化学混合物处理不会导致成纤维细胞产生非特异性细胞身份标记(不产生ipsc)。
2.没有在RNA-seq数据集中观察到iPSC特异性基因或基因模块的表达。
3.使用免疫荧光法寻找在所有鸡尾酒治疗后多能性相关基因如NANOG和EPCAM的表达迹象，但没有发现任何表达。
综上，这些数据表明化学鸡尾酒配方只是部分重编程细胞，而不是将细胞完全重置为多能性。
小分子可以在不丧失细胞特性的情况下逆转转录组的年龄
测试这六种鸡尾酒配方对细胞转录组年龄(tAge)的影响。使用啮齿动物转录组时钟，人类和啮齿动物的组合转录组时钟评估相对转录年龄。与静止细胞相比，衰老细胞的转录组年龄显著增加。用六种化学混合物(C1-6)中的每一种处理NCC细胞，导致衰老细胞的转录组年龄在统计学上显著降低。
研究根据年轻和衰老细胞中的蛋白质区隔化和基因表达模式提供证据，证明小分子可以逆转细胞的转录组年龄，而不会消除细胞身份或诱导ipsc样状态。作者把这种方法称为EPOCH方法。NCC系统作为生物年龄逆转的替代生物标志物具有效性，以年轻、年老、衰老、HGPS和osk处理的细胞系作为对照，应该为更大、更广泛的年轻化因子筛选奠定基础。后续研究正在进行中，以阐明介导这些返老返老作用的细胞机制。
意义
NCC的破坏是一个公认的跨物种衰老效应，和多种疾病直接相关，包括肌萎缩侧索硬化症(ALS)和额颞叶痴呆(FTD)。研究表明，在复制性衰老细胞中，表达OSK可显著改善核胞质区隔化的完整性。因此，对EPOCH化学鸡尾酒如何恢复NCC完整性和蛋白质分配的进一步研究可能为改善老年人和患有特定细胞类型和组织的年龄相关疾病的患者的健康提供治疗途径。
OSK和逆龄鸡尾酒对表观遗传重编程的转录组学分析表明，这些干预措施广泛改善了衰老的特征，如衰老相关基因表达模式的显著变化，包括炎症、线粒体代谢、溶酶体功能、凋亡、p53和生长信号。此外，从转录组时钟观察到，所有六种化学鸡尾酒C1-C6都使生物年龄和实足年龄降低到甚至低于非衰老细胞群体的水平，这表明鸡尾酒是有效的，能够逆转衰老相关的细胞功能障碍。尽管以小鼠和人类为基础的化学混合物的组成不同，但它们影响的大多是同一组基因，这表明这种影响可能是通过共同的途径起作用的。
分析化学鸡尾酒配方对来自年轻人和老年人的各种细胞类型的影响的实验仍在进行中。目前最有效的逆龄化学鸡尾酒是VC6TF。鉴于VC6TF尚未被报道能够将人类细胞完全重编程为CiPSCs，并且任何化学处理的最长持续时间仅限于四天，该研究证实了返老返老的概念是重编程早期阶段固有的，并且至少部分可与多能性程序分离。
这项研究的重点是生理年轻化和分析特定的和成熟的衰老表观基因组特征。化学重编程是否能减弱或逆转衰老的其他特征，以及它对非衰老细胞和不同细胞类型、组织和物种的效果如何，还需要进一步的探索。目前正在进行实验，以确定重编程结束后恢复活力效果的持久性以及化学EPOCH (cEPOCH)的工作机制。
未来的工作将旨在了解这些和其他EPOCH治疗的效果在体内持续多长时间，以及它们是否逆转衰老方面并延长小鼠寿命，并与AAV-OSK并行治疗。在这项研究中开发的分析方法，结合日益强大的人工智能，将促进越来越多的生物制剂和小分子的筛选，最终安全地逆转哺乳动物的衰老。考虑到衰老是人类疾病和痛苦的最大贡献者，这些进步更应尽快实现。
相关性和潜在应用
哈佛大学的研究小组此前通过病毒载体将特定的山中基因插入细胞，已经展示了在不引起不受控细胞生长的情况下逆转细胞衰老的可能性。对如视神经、大脑、肾脏和肌肉等各种组织和器官的研究，已经取得了令人鼓舞的结果，包括改善小鼠的视力和延长寿命。最近的报告也记录了猴子视力的改善。
通过建立一种替代基因治疗的化学疗法来逆转年龄，这项研究可能会改变衰老、损伤和年龄相关疾病的治疗方法，为再生医学和潜在的全身恢复铺平了道路，具有深远意义。该方法还提出了降低开发成本和缩短开发时间的可能性。继2023年4月在猴子身上成功逆转失明后，目前正在计划使用该实验室的年龄逆转基因疗法进行人体临床试验
研究小组的意见
“直到最近，我们能做的最好的事情就是延缓衰老。新的发现表明我们现在可以逆转它，”David A. Sinclair说，他是遗传学教授和哈佛医学院保罗F.格伦衰老生物学研究中心联合主任，该项目的首席科学家。“这个过程以前需要基因治疗，限制了它的广泛使用。”
哈佛大学的研究小组设想，在未来，与年龄有关的疾病可以得到有效治疗，损伤可以更有效地修复，全身返老还童的梦想成为现实。“这项新发现提供了只用一粒药丸就能逆转衰老的潜力，其应用范围从改善视力到有效治疗许多与年龄有关的疾病。”
配方中的一些组分
CHIR99021是一种GSK3α/β抑制剂，是CiPSCs的有效诱导剂和某些干细胞特性的启动子。E-616452也被称为RepSox，是一种TGF-β抑制剂，在实验中被用于在表观遗传重编程过程中替代SOX2。所有有效的重编程化学鸡尾酒都包含这些化合物，这表明这些成分共同对处理细胞群体的细胞再生起着强有力的作用。多个研究小组已经观察到含有CHIR99021和E-616452的化学混合物可以诱导分化细胞状态之间的直接重编程。这是很重要的，因为它表明重写和替换细胞表观遗传身份的过程受到这些化合物的加性效应的影响。此外，独立研究发现，在各种情况下，个体化学物质与重编程存在关联，表明每种成分都可能通过广泛的机制促进衰老。
丙戊酸是一种众所周知的广谱组蛋白去乙酰化酶抑制剂，可导致组蛋白乙酰化标记在基因组中迅速而显著地传播。丙戊酸是许多成功鸡尾酒的关键成分，这一事实表明，常染色质的扩散可能是部分表观遗传重编程的重要组成部分。丁酸钠是另一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂，在人和小鼠鸡尾酒中都有效。据报道，它可以改善与重编程相关基因的表达，支持组蛋白乙酰化标记的调节对于通过重编程实现返老还童至关重要的模型。最有效的C1鸡尾酒中的最后一种化学物质福斯克林是腺苷酸环化酶的活化剂，已被证明可以驱动重编程和反式分化，取决于其他化合物的组合。虽然福斯克林在恢复活力方面的作用机制仍有待确定，但增加细胞cAMP水平和触发对细胞身份适应至关重要的信号级联可能是关键。
参考文献
Chemically induced reprogramming to reverse cellular aging
