近日，中科院生物物理所研究员王立堃团队发现，肿瘤细胞在经历内质网应激的时候，能挟持一个叫 XBP1 的转录因子，自己制造胆固醇。
而胆固醇能以小细胞外囊泡的形式，分泌到细胞外之外，并被一类叫骨髓来源抑制性细胞的肿瘤浸润免疫抑制性细胞所摄取，进而起到抑制抗肿瘤免疫的作用。
图 | 王立堃
通过上述方法，肿瘤细胞可以逃脱细胞毒性 T 细胞的攻击，从而促进自身生长。而采用小分子抑制剂阻止 XBP1 的产生、亦或是降低胆固醇的含量，可以有效减缓肿瘤的生长。
之前，有不少研究将未折叠蛋白响应，作为肿瘤治疗的潜在靶点，一些小分子抑制剂或激活剂也已进入临床前的研究，不过尚无真正进入临床使用的药物。
美国安进公司曾报道了筛选出的靶向 IRE1α 的小分子抑制剂，可以抑制其下游 XBP1s 的产生，并称其在多株天然肿瘤细胞系中，均未发现通过抑制 IRE1α 通路，可以有效地阻止肿瘤细胞的生长。
“而这与我们肿瘤细胞体外培养的实验结果是一致的。有趣的是，我们发现肿瘤细胞生长对 XBP1s 的依赖性，只在免疫功能正常的小鼠中才体现出来。这也提醒我们对于肿瘤的研究或是对于肿瘤药物的筛选，不能忽视免疫系统的存在。也许通过调整这一思路，对于将未折叠蛋白响应作为抗肿瘤的靶点，人们可以获得新的认识和应用。”王立堃表示。
（来源：Cell Metabolism）
01
首次发现 XBP1 直接上调胆固醇合成酶的表达
据介绍，王立堃课题组长期关注内质网应激和未折叠蛋白响应。内质网，是细胞中负责蛋白质折叠和转运、脂质合成及转运的重要细胞器。
不过，对于很多细胞来说，都会受到内在因素和外来因素的干扰，比如基因突变、大量分泌蛋白的合成、缺氧、病原入侵等，这会让蛋白质的折叠和转运受到阻碍，从而导致未正确折叠的蛋白在内质网腔中累积。
就像一个蛋白质“加工厂”，由于产品质量不过关、或是产能过剩造成了产品积压。而在细胞里，这种现象被称为“内质网应激”。
当然，“加工厂”会将这种情况报告上级，或是告诉别的细胞器，大家齐心协力共度难关，这一过程叫做“未折叠蛋白响应”。
即当发生内质网应激时，内质网通过一系列信号通路告诉细胞核，随后启动某些特定基因的表达，通过产生更多可以帮助蛋白质折叠的分子伴侣和折叠酶（增加工人数量）、扩大内质网体积（加盖生产车间）、降解未折叠蛋白（及时处理残次品）等手段，帮助内质网尽快恢复正常状态，或是降低蛋白翻译速率以减缓内质网压力（停业整顿）。
在肿瘤细胞和免疫细胞中，内质网应激现象和未折叠蛋白响应都十分常见，它们对于这些细胞的生存和活性也很重要。
比如有研究发现，当肿瘤细胞面临不利的生存环境时，它可以利用未折叠的蛋白响应，来抵御这些不利因素造成的内质网应激；而免疫细胞分泌抗体、细胞因子等蛋白质，它们也走在抵抗病原入侵、清除异物的“前线”，因此要想正常发挥功能，也得依赖未折叠蛋白响应。
但是，对于肿瘤细胞如何利用自身的未折叠蛋白响应信号，去影响周围的细胞特别是免疫细胞，目前人们还知之甚少。
（来源：Cell Metabolism）
而本次工作发现：肿瘤细胞的这种响应信号，可以跨细胞影响免疫细胞，进而阻止免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤。这也说明，在肿瘤这样复杂的疾病中，内质网应激信号是可以在不同细胞之间传递的。
据介绍，在未折叠蛋白响应通路之一的 IRE1α 下游，XBP1 是非常重要的转录因子，承担着将内质网应激信号报告给细胞核的作用。
当发生内质网应激时，IRE1α 的激活能导致 XBP1 mRNA 的特异性剪接，这种剪接会导致具备转录因子活性的 XBP1 蛋白的产生。XBP1 继而进入细胞核，与 DNA 上的某些特定基因片段结合，进而启动它们的转录。
此次研究发现在肿瘤细胞中，对于一些参与胆固醇合成的酶的基因转录的启动子区，XBP1 能直接和其进行结合。通过上调这些基因的表达，可以提高肿瘤细胞合成胆固醇的能力。
王立堃表示：“关于未折叠蛋白响应可以影响脂质合成的发现，以前也有过不少报道。但是，XBP1 直接上调胆固醇合成酶的表达，是我们首次发现的。”
（来源：Cell Metabolism）
对于肿瘤相关临床数据库的分析显示，XBP1 在多种肿瘤组织中是高表达的，这暗示着其可能与肿瘤的发生发展，存在一定相关性。
研究中，该团队将小鼠黑色素瘤细胞系 B16.F10（以下简称 “B16”）和结肠癌细胞系（MC-38），移植到小鼠皮下。待其成瘤后检测，确实能观察到 XBP1 的表达。这说明，肿瘤细胞发生了内质网应激，启动了未折叠蛋白响应。
然而在免疫缺陷小鼠中，缺失 XBP1 的肿瘤细胞的生长速率并不受影响，只在接种到免疫系统完整的小鼠身上，才表现出明显慢于野生型细胞成瘤的速率。这说明，肿瘤细胞的 XBP1 能通过某种方式来影响免疫系统，从而促进肿瘤生长。
事实上，肿瘤组织极为复杂，存在不同类型免疫细胞的浸润。目前，肿瘤微环境、特别是肿瘤免疫的相互调节，已受到学界的广泛关注。近来颇为热门的肿瘤免疫疗法，正是基于上述理论。
肿瘤细胞能分泌大量的功能分子，这些分子可以影响免疫细胞活性。反过来，免疫细胞也能调控肿瘤细胞。而免疫细胞和肿瘤细胞之间也在相互影响，就像是一场“混战”，其间不乏各种“明争暗斗”和“卧底伪装”。
课题组还发现，肿瘤细胞中 XBP1 的缺失，会显著下调肿瘤组织中的骨髓来源抑制性细胞的比例，同时还伴有 CD8+T 细胞比例的增加。
此外，XBP1 的缺失还会降低肿瘤组织中胆固醇的含量，这和前文所述的 XBP1 会促进胆固醇合成关键基因转录是一致的。
有趣的是，体外实验和体内实验都证实了如下规律：在骨髓来源抑制性细胞的扩增和活化中，胆固醇起着重要作用。由于骨髓来源抑制性细胞是一类免疫抑制细胞，而此前研究以及本次实验数据均表明，其能抑制 CD8+T 细胞的活性，CD8+T 细胞则能杀伤肿瘤细胞。
打个比方，肿瘤细胞趁着内质网蛋白质“加工厂告急”，“挪用”未折叠蛋白响应信号分子 XBP1 制造胆固醇，而这些胆固醇还能“出口”到骨髓来源抑制性细胞，“吃饱喝好”的骨髓来源抑制性细胞数量增加了、活性也增强了，于是针对 CD8+T 细胞对肿瘤细胞的打击，发出了猛烈反击。
这样一来，通过上调胆固醇的合成，可以增加胆固醇的分泌。这时，肿瘤细胞就能实现抑制抗肿瘤免疫、为自我成长铺平道路的目的。
但是，肿瘤细胞的胆固醇是如何“出口”到骨髓来源抑制性细胞的？这就必须提到一类名为小细胞外囊泡的单层膜结构囊泡。
近年来，有研究发现在细胞间物质传递中，小细胞外囊泡发挥着重要作用。此外，对于肿瘤细胞通过小细胞外囊泡分泌微小 RNA、或蛋白影响周围环境的研究，也不在少数。
据介绍，小细胞外囊泡也是胆固醇的载体。而此次研究发现，XBP1 缺失正是通过减少小细胞外囊泡上胆固醇的含量，降低了肿瘤细胞胆固醇的分泌。
通过这种方式，疏水的胆固醇分子得以越过细胞间亲水环境的“汪洋大海”，来到骨髓来源抑制性细胞旁边。
而骨髓来源抑制性细胞则通过一种叫“巨胞饮作用”的方式去摄取胆固醇分子，进而发生扩增和激活。
如果通过抑制剂处理、或是基因敲除的手段来阻止肿瘤细胞小细胞外囊泡的产生，肿瘤生长就会受到抑制。而在肿瘤组织中，骨髓来源抑制性细胞细胞和 CD8+T 细胞的比例，也会分别出现减少和增加。
这说明，小细胞外囊泡除了可以运输 RNA 和蛋白质外，也能作为胆固醇的载体，在细胞间的信号传递中发挥作用。
既然 XBP1 信号通路能通过上调胆固醇的合成和分泌，来抑制抗肿瘤免疫。那么，在接种了肿瘤细胞的小鼠体内，注射这一信号通路的抑制剂，能否同样抑制肿瘤生长呢？
实验结果显示，在 XBP1 上游的未折叠蛋白里，响应蛋白 IRE1α 的抑制剂 KIRA8，确实能减缓肿瘤的生长，同时也伴随着肿瘤组织中胆固醇含量的下降、骨髓来源抑制性细胞细胞数量的减少、以及 CD8+T 细胞数量的增加。
这也意味着在小鼠模型上，该团队证实了该通路对肿瘤的影响。不仅如此，KIRA8 和当前广受关注的免疫检查点抑制剂—PD-1 抗体联用之后，可以在黑色素瘤模型上表现出更好的效果。
要知道，有些肿瘤对于免疫疗法并不敏感，而通过 KIRA8 重新调动免疫系统的积极性，与 PD-1 抗体联合治疗或可助力于这些肿瘤的治疗。
值得一提的是，KIRA8 是由美国安进公司最早报道的一种 IRE1α 抑制剂，其通过体外实验表明，IRE1α 抑制剂对于杀伤肿瘤细胞没有显著效果。但是，这并未考虑到免疫系统的影响。
而在本次研究中，课题组考虑了免疫系统对肿瘤的影响，KIRA8 的效果也被显示出来。同时也证实了：如果在免疫缺陷小鼠上接种 B16 黑色素瘤细胞，KIRA8 的确不会产生抗肿瘤效果。
近日，相关论文以《癌细胞固有的 XBP1 通过促进胆固醇的产生来驱动肿瘤浸润髓系细胞的免疫抑制重编程》（Cancer cell-intrinsic XBP1 drives immunosuppressive reprogramming of intratumoral myeloid cells by promoting cholesterol production）为题发表在 Cell Metabolism 上（IF 31.37），Zaili Yang 是第一作者，王立堃担任通讯作者 [1]。
图 | 相关论文（来源：Cell Metabolism）
可以说，尽管很多研究都揭示了骨髓来源抑制性细胞可以促肿瘤的作用，以及 XBP1s 能促进肿瘤恶性进展中的多种机制，该工作发现肿瘤细胞 XBP1s 直接调控了胆固醇生物合成相关基因表达，并利用细胞外囊泡“远程调控“抗肿瘤免疫，这些新的实验数据也提高了人们的认识。
02
“只要认真对待问题，别人也会认真帮助你”
原本在研究初期，该团队只是想更好地理解未折叠蛋白反应，在细胞与细胞间信号交流中的调节作用。
肿瘤组织包含多种不同的细胞，包括肿瘤细胞和免疫细胞，是一个非常典型的研究模型。因此，他们首先探索了肿瘤细胞内的 IRE1α/XBP1 信号通路，对于肿瘤内的免疫细胞的影响。
由于该实验室在肿瘤免疫方面没有任何基础，期间也是颇费周折。“很幸运的是，生物物理研究所有着非常优秀肿瘤免疫学科学家，他们给予了莫大的帮助，尤其是杨鹏远老师实验室和傅阳心/彭华老师实验室。”王立堃说。
经过反复的探索，并通过质谱流式技术和流式细胞术分析，最终他们确定了肿瘤细胞的 XBP1，可以影响肿瘤微环境中骨髓来源抑制性细胞的数量和功能。
之后，课题组开始寻找到底哪些受 XBP1 调控的因子，会作用于骨髓来源抑制性细胞。刚开始，受固有思维的限制，他们想寻找一些新的、可以刺激骨髓来源抑制性细胞扩增和活化的细胞因子，然而却以失败告终。
随后，结合转录组测序分析和体外实验验证，研究团队终于找到了受 XBP1 调控的胆固醇，它可以刺激骨髓来源抑制性细胞的活化和扩增。
在寻找传递胆固醇的载体过程中，王立堃实验室的博士生周仕新提供了大量帮助，他在外泌体方向上有着丰富的经验。在这一阶段，他们确定了这一理论：外泌体是将肿瘤细胞胆固醇、传递到骨髓来源抑制性细胞的重要载体。
随后，课题组探讨了骨髓来源抑制性细胞接收胆固醇的机制。“其中，主要从事细胞运动和胞饮机制研究的蔡华清老师，给予了非常好的指导。最终，我们明确了骨髓来源抑制性细胞，主要通过巨胞饮作用，来接收肿瘤细胞传递过来的胆固醇。”王立堃表示。
最后，在明确 XBP1 信号通路调节肿瘤免疫的机制后，其又发现通过小分子化合物阻断 XBP1 信号，可以有效地抑制肿瘤的生长。如前所述，其与已上市肿瘤免疫药物 PD-1 抗体联合使用，能更有效地限制肿瘤的生长。
其实，在肿瘤细胞和骨髓来源抑制性细胞之间，对于胆固醇是信号传递的关键分子的这一细节，研究团队一开始压根没往这里想，想当然地觉得应该是蛋白类的细胞因子。当然这也很合理，毕竟细胞因子在肿瘤免疫中起着重要作用。
但是，一系列的实验走下来，结果总是似是而非，科研进度也被拖慢。后来他们就想，万一不是蛋白质呢？于是开始考虑到脂质，因为内质网除了和蛋白转运密切相关，在脂质合成与转运中也起着很重要的作用。
王立堃说：“为此我们还和所里的刘平生老师讨论过几次。后来通过组学分析，再结合体外实验，逐渐明确了胆固醇在其中的关键作用。期间，我们向很多肿瘤、免疫、脂质代谢方面的老师请教了不少问题，他们都是慷慨地给予帮助。这种自由融洽的学术氛围，也是顺利开展工作的必要条件。”
（来源：Cell Metabolism）
而投稿过程也让王立堃颇有感慨，课题组之前没有肿瘤免疫的研究经验，而且这是实验室成立后第一篇独立发表的论文。
他说：“有一种说法是，顶尖杂志的编辑会看你的研究背景，假如是这个领域的新手，他们会天然地带着更加苛刻的态度来审视论文。不过整个审稿过程给我们的感觉是，无论是编辑还是匿名审稿人，都是非常客观地评价和提出建议。”
在第一轮审稿中，有一位显然是免疫学背景的审稿人提了不下 20 个问题，大部分都很难，而且对方在评语中直言不讳地指出，这项工作在免疫学上存在很多漏洞。
后来，该团队耗时 5 个月补充论文，也发现通过解决这些问题，对于论文质量的提升很有帮助。针对评审意见返回修改稿之后，这位审稿人的态度明显大转弯。
“我觉得无论你是否是一个新手，只要认真对待问题，勇于承认自己的不足，别人也会很认真地帮助你。”王立堃表示。
后续，课题组打算进一步探索胆固醇究竟如何影响骨髓来源抑制性细胞细胞的。目前来看，一种可能是胆固醇在骨髓来源抑制性细胞上也造成了内质网应激，这在 T 细胞的相关研究中也有过报道。
但是，也有可能是胆固醇改变了细胞膜的结构，导致了一些膜定位信号分子的活性改变。当然，胆固醇也可能参与细胞代谢，而这些都是有趣的问题。
此外，目前对于胆固醇在抗肿瘤免疫中的作用，人们的理解不尽相同。而此次研究和其他一些研究显示，胆固醇具有抑制抗肿瘤免疫的功能，但也有研究发现其能促进抗肿瘤免疫，这也是肿瘤免疫复杂性的体现。那么，高胆固醇饮食到底会增大还是减少患癌风险？这将是王立堃研究的“下一站”。
参考资料：
1.Yang, Z., Huo, Y., Zhou, S., Guo, J., Ma, X., Li, T., ... & Wang, L. (2022). Cancer cell-intrinsic XBP1 drives immunosuppressive reprogramming of intratumoral myeloid cells by promoting cholesterol production.Cell Metabolism, 34(12), 2018-2035.
