猴痘病毒，这个天花病毒的神秘近亲，正在全球范围内肆虐。 迄今已有近8万人沦陷于其威胁之下。为了及时上报疑似病例并掌握疫情的动态，快速而精确地检测猴痘病毒成为每个卫生部门的当务之急。
2022年9月，中国科学院上海巴斯德研究所研究员Nicolas Berthet、王颂基等在 Viruses 上发表了一篇题为“Development and Characterization of Recombinase-Based Isothermal Amplification Assays (RPA/RAA) for the Rapid Detection of Monkeypox Virus”的研究，他们成功研发出三种可以在20至30分钟内快速、简便、直观地诊断猴痘病毒的方法。这些方法不仅与现行的qPCR核酸检测方法结果高度一致，而且更加迅速、直接。
猴痘是一种临床症状与天花相似，但相对较温和的疾病，其致死率约为1%—10%。虽然历史上主要在中非与西非流行，但近些年来，猴痘病毒正日益成为全球关注的焦点，促使人们深入研究它。
MPXV核酸检测对于监测和诊断工作至关重要，有助于通过积极识别感染病例来减少病毒传播。目前，用于诊断猴痘的方法主要包括病毒分离、电子显微镜和聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）等。MPXV检测的黄金标准是real-time PCR，因为它具有高灵敏度和特异性。然而，由于设备和技术限制，该方法在一些MPXV流行的资源匮乏地区并不总是可行的。因此，简单的现场检测对于快速、方便地诊断MPXV感染至关重要。
图1. 实时 RPA 和 RPA-Cas12a 检测系统的灵敏度
本研究中所报道的检测方法是基于重组聚合酶对病毒基因组的目标区域进行等温扩增，并分别与CRISPR/Cas12、核酸外切酶以及横向流动试纸条相结合而开发的。研究人员使用三种检测方法对19份提取自中非临床样本的DNA进行检测验证，检测结果与传统检测定量PCR的结果一致。此外，这些方法具有特异性，不会与其他正痘病毒（如痘苗病毒）发生交叉反应。这些诊断方法的开发为MPXV快速检测提供了新的、便捷的选项，将有助于控制和预防MPXV的流行。
图2. RAA-LFS 检测的灵敏度和特异性
图3. 使用三种方法在临床样本中检测MPXV，并与real-time PCR 进行比较
利用real-time RPA和RAA-LFS进行MPXV 检测的结果与real-time PCR结果显示出高度的一致性（100%），RPA-Cas12a则显示出83.3%的一致性。在低浓度核酸扩增过程中，将少量扩增产物转移到新管中时，可能会出现局部快速扩增，造成进样误差，导致检测灵敏度降低。因此在未来的研究中，有必要将RPA-Cas12a方法进一步优化为单管检测，以提高灵敏度。
基于环介导等温扩增的等温扩增测定技术（Isothermal Amplification Assays based on Loop-mediated Isothermal Amplification, LAMP）此前已用于MPXV检测开发。尽管该检测也不需要特定的实验室设备，但与nested PCR 的结果相比，该检测仅具有72%的一致性，且需要大约60分钟才能生成结果。此外，LAMP MPXV 检测需要六对引物，但三种基于重组酶的扩增检测只需要一对引物和一个探针，从而简化了诊断设计。之前发表的针对 G2R 基因的 MPXV-RPA 检测结果与我们的real-time RPA 结果一致，但需要专门的仪器和训练有素的实验室工作人员，这限制了其在非专业人士家庭使用的实用性。相比之下，RAA-LFS 更加用户友好，因为其操作简单，并且与其他基于试纸的检测（例如 pH 或妊娠测试）相似，这使得在家自我检测更加可行。
总的来说，这项研究成功地将RPA/RAA技术与CRISPR-Cas系统相结合，开创了一个快速、准确、方便的猴痘病毒检测平台。这不仅为当前的疫情检测提供了强有力的支持，更为未来的防控工作打下了坚实的基石。
原文链接：https://www.mdpi.com/1999-4915/14/10/2112
参考文献：Mao L, Ying J, Selekon B, Gonofio E, Wang X, Nakoune E, Wong G, Berthet N. Development and Characterization of Recombinase-Based Isothermal Amplification Assays (RPA/RAA) for the Rapid Detection of Monkeypox Virus. Viruses. 2022 Sep 23;14(10):2112. doi: 10.3390/v14102112. PMID: 36298667; PMCID: PMC9611073.
